Untersuchung zur Ionenleitfähigkeit eines pflanzlichen Proteins mit Homologie zu den tierischen “Chloride Intracellular Channels“ (CLICs)

Anionenkanäle sind in den Membranen aller Eukaryonten vorhanden und wichtig für viele physiologische Prozesse. Pflanzliche Anionenkanäle wurden in den vergangenen Jahren intensiv mit elektrophysiologischen Methoden untersucht, über die molekularen Eigenschaften der pflanzlichen Anionenkanäle ist jedoch nach wie vor sehr wenig bekannt. Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag deshalb in der Untersuchung, ob ein Homolog zu den tierischen “Chloride Intracellular Channels“ (CLICs), das pflanzliche Protein AtCLIC, als Anionenkanal funktionieren kann. Um diese Fragestellung zu bearbeiten, wurden insbesondere spezielle elektrophysiologische, proteinbiochemische und mikroskopische Methoden angewendet. Die wesentlichen Ergebnisse aus diesen Untersuchungen können wie folgt zusammengefasst werden: Es konnte aufgezeigt werden, dass im Genom von Arabidopsis thaliana ein Protein codiert ist, das eine grosse Ähnlichkeit mit dem intrazellulären Chloridkanal CLIC1 aus Homo sapiens aufweist. Dieses Protein, im folgenden AtCLIC genannt, gehört zur Klasse der Dehydroascorbat-Reduktasen (DHARs) aus der Familie pflanzlicher Gluthathion-S-Transferasen (GSTs). AtCLIC zeigt jedoch deutlich höhere Sequenzidentitäten zu Vertretern der tierischen CLIC-Familie, als zu den pflanzlichen GSTs aus A. thaliana. Vergleiche der Phylogenie gaben einen Hinweis darauf, dass beide Familien, die der GSTs und der CLICs, einen gemeinsamen Vorfahren haben könnten. Weiterhin wurde mit Hilfe der "Patch-Clamp-Technik" nachgewiesen, dass das Protein AtCLIC in humanen embryonalen Nierenzellen (HEK293) und Ovarienzellen des chinesischen Hamsters (CHO-K1) eine einwärtsgleichrichtende Leitfähigkeit mit geringer Chloridselektivität induziert. Bei Inhibierungsexperimenten wurde deutlich, dass der untersuchte Kanal sensitiv auf den Anionenkanal-Inhibitor IAA-94 reagiert. Mittels Lokalisationsstudien durch confokale Laserscanning Mikroskopie wurde mit Hilfe des Fusionsproteins AtCLIC::GFP die Verteilung von AtCLIC im heterologen System HEK293-Zelle untersucht. Dabei wurde die Vermutung bestätigt, dass sich das Protein sowohl gelöst im Cytosol als auch in der Plasmamembran aufhält. Dies zeigte sich besonders an hoch membranösen Zellstrukturen, den Filopodien. Durch Colokalisation mit dem Membranfarbstoff Fm4-64 konnte eine Membranlokalisation des Proteins AtCLIC bestätigt werden. Auch bei einer proteinbiochemischen Lokalisationsstudie wurde das Fusionsprotein AtCLIC::GFP sowohl im Cytosol als auch in der Membran der Zellen nachgewiesen. Das pflanzliche Protein AtCLIC aus A. thaliana ist also strukturell nah mit dem tierischen Anionenkanal CLIC1 verwandt und induziert eine erhöhte Membranleitfähigkeit, wenn es in einer Zelle exprimiert wird. Die Ergebnisse aus den vorliegenden Untersuchungen und Experimenten legen die Vermutung nahe, dass das pflanzliche Protein AtCLIC ein Kanal ist, der ein Anionenkanal am Tonoplasten von Pflanzen sein kann